Um certificado apresenta um pico alto e estreito e um resultado de pureza superior a 99%. Parece tranquilizador. Para um investigador, porém, a questão interessante é saber o que o instrumento contou para chegar a essa percentagem.

A resposta começa com o cromatograma. Trata-se de um registo da resposta do detetor ao longo do tempo, e não de uma fotografia de tudo o que se encontra no frasco. Aprender a interpretar esse registo torna o valor da pureza mais informativo e ajuda a explicar por que razão este deve ser considerado em conjunto com os resultados relativos à identidade e ao conteúdo.

Acompanhe a amostra ao longo da coluna

A HPLC combina uma separação com uma medição. Os constituintes passam por uma coluna, interagindo de forma diferente com as fases estacionária e móvel. Os que são separados por este método chegam ao detetor em momentos diferentes.

Na cromatografia de péptidos em fase inversa, as condições da fase móvel, o gradiente e outras opções do método influenciam a retenção e a separação. A descrição metodológica de Mant e colegas explica estas relações e as diferentes abordagens cromatográficas disponíveis para os péptidos. Não existe um único conjunto de condições de HPLC que determine todos os resultados de pureza. Mant et al.: Análise e purificação de péptidos por HPLC.

No traçado resultante, um pico corresponde a um período de resposta acrescida do detetor. A integração atribui-lhe uma área, aplicando uma linha de referência e as regras de processamento do método. O laboratório atribui então os picos e decide quais as áreas que devem ser incluídas no cálculo apresentado no relatório.

A percentagem é um cálculo cujo denominador é

Num resultado de normalização de área, a área-alvo atribuída é dividida pela área total incluída e multiplicada por 100. O denominador é tão importante quanto o pico-alvo. Um sinal excluído, um limiar de integração ou uma contribuição não resolvida alteram o que o cálculo descreve.

O que o detetor deteta não é tudo o que o material contém

A composição de um material peptídico pode incluir água, contra-iões e solventes residuais. Estas contribuições não são necessariamente representadas num cálculo de rotina da pureza por área UV do peptídeo. Uma elevada percentagem de área e uma fração em peso mais baixa do peptídeo podem, por conseguinte, descrever aspetos diferentes do mesmo material.

O relatório técnico da IUPAC, publicado pelo NIST, sobre a atribuição da pureza de compostos orgânicos aborda o equilíbrio de massas e as abordagens quantitativas, incluindo as contribuições das impurezas e a incerteza. Essa atribuição mais abrangente constitui uma tarefa analítica diferente da expressão de um pico como proporção de um cromatograma. NIST/IUPAC: atribuição do valor de pureza de compostos orgânicos.

Isto torna-se especialmente relevante quando um investigador necessita de uma quantidade definida para uma experiência quantitativa. O cromatograma pode ajudar a caracterizar a distribuição das espécies detetadas, enquanto uma medição calibrada do teor determina a quantidade do analito em questão.

Um pico de grandes dimensões ainda precisa de uma identidade

O tamanho do pico e a atribuição do pico são conceitos distintos. Um sinal dominante pode pertencer ao péptido pretendido, a uma espécie inesperada ou a contribuições não identificadas. A designação atribuída a esse pico necessita de provas analíticas que a sustentem.

A coelução é o conceito particularmente útil neste contexto: os constituintes que o procedimento não consegue separar podem contribuir para o mesmo pico. Um traçado com bom aspeto não faz com que esta questão desapareça. O que importa é saber se o método consegue distinguir as espécies importantes para a análise.

A norma ICH Q2(R2) considera a identificação, a determinação da concentração e a medição de impurezas como finalidades analíticas distintas, sendo que as características de validação, tais como a seletividade, a exatidão e a precisão, são avaliadas em função da tarefa pretendida. Esta orientação relativa a métodos farmacêuticos fornece um quadro útil para compreender o desempenho das medições; não atribui, contudo, estatuto farmacêutico a um reagente de investigação. ICH Q2(R2): validação de procedimentos analíticos.

Dois relatórios podem estar de acordo sem responderem à mesma pergunta

Consideremos dois relatórios fictícios, ambos indicando uma pureza de área de 99,1%. O Relatório A inclui uma referência ao vestígio e ao método. O Relatório B também identifica o pico alvo, fornece provas de identidade separadas e apresenta um valor de teor calibrado.

No que diz respeito a um estudo de calibração quantitativa, o Relatório B fornece informações que faltam no Relatório A. Isso não significa que o seu conteúdo seja superior. Significa apenas que a documentação responde a mais perguntas do investigador.

Agora, mudemos de tarefa. O investigador está a analisar um perfil de impurezas antes e depois de uma experiência de tensão realizada em laboratório. A comparação requer condições analíticas e de processamento compatíveis. É difícil interpretar uma diferença entre as percentagens se uma análise incluir um pequeno ombro no pico alvo e outra o integrar separadamente.

Leia a precisão sem a interpretar em excesso

Um resultado de 99,3 % é numericamente superior a 99,0 %. O facto de essa diferença ser significativa ou não depende do contexto da medição. As casas decimais adicionais tornam um relatório mais detalhado; por si só, não demonstram maior precisão nem um material de melhor qualidade.

Da mesma forma, um valor de 100% pode significar que nenhum pico adicional incluído excedeu o limiar de relatório do procedimento. Trata-se, ainda assim, de uma observação limitada ao método. A descrição mais útil mantém-se fiel a essa observação: pureza de área por HPLC ao abrigo do procedimento indicado, com o traço original disponível para interpretação.

Âmbito laboratorial: Este artigo diz respeito à interpretação cromatográfica para fins de investigação. Uma percentagem de pureza não determina a adequação para uso humano ou veterinário.