Ein Zertifikat weist einen hohen, schmalen Peak und einen Reinheitswert von über 99 % aus. Das wirkt beruhigend. Für einen Forscher stellt sich jedoch die interessante Frage, was das Gerät gezählt hat, um diesen Prozentsatz zu ermitteln.

Die Antwort lässt sich anhand des Chromatogramms finden. Es handelt sich dabei um eine Aufzeichnung der Detektorantwort im Zeitverlauf und nicht um eine Momentaufnahme des gesamten Inhalts des Fläschchens. Wenn man lernt, diese Aufzeichnung zu interpretieren, wird der Reinheitswert aussagekräftiger und es lässt sich besser erklären, warum er neben den Ergebnissen zur Identifizierung und zur Zusammensetzung steht.

Folgen Sie der Probe durch die Säule

Bei der HPLC werden Trennung und Messung kombiniert. Die Bestandteile durchlaufen eine Säule und interagieren dabei unterschiedlich mit der stationären und der mobilen Phase. Die durch dieses Verfahren aufgetrennten Bestandteile erreichen den Detektor zu unterschiedlichen Zeitpunkten.

Bei der Umkehrphasen-Peptidchromatographie beeinflussen die Bedingungen der mobilen Phase, der Gradient sowie weitere methodische Entscheidungen die Retention und die Trennung. Der methodische Bericht von Mant und Kollegen erläutert diese Zusammenhänge sowie die verschiedenen chromatographischen Ansätze, die für Peptide zur Verfügung stehen. Es gibt keine einheitlichen HPLC-Bedingungen, die jedes Reinheitsergebnis bestimmen. Mant et al.: HPLC-Analyse und Reinigung von Peptiden.

Auf der resultierenden Kurve stellt ein Peak einen Zeitraum dar, in dem die Detektorantwort erhöht ist. Durch Integration wird ihm eine Fläche zugewiesen, indem eine Basislinie festgelegt und die Verarbeitungsregeln der Methode angewendet werden. Das Labor ordnet anschließend die Peaks zu und entscheidet, welche Flächen in die ausgewiesene Berechnung einfließen sollen.

Der Prozentsatz ergibt sich aus einer Berechnung mit einem Nenner

Bei der Flächennormalisierung wird die zugewiesene Zielfläche durch die gesamte einbezogene Fläche geteilt und mit 100 multipliziert. Der Nenner ist ebenso wichtig wie der Zielpeak. Ein ausgeschlossenes Signal, ein Integrationsschwellenwert oder ein nicht aufgelöster Beitrag verändern die Aussagekraft der Berechnung.

Was der Detektor erfasst, ist nicht alles, was das Material enthält.

Die Zusammensetzung eines Peptidmaterials kann Wasser, Gegenionen und Lösungsmittelrückstände umfassen. Diese Anteile werden bei einer routinemäßigen Berechnung der UV-Flächenreinheit von Peptiden nicht unbedingt berücksichtigt. Ein hoher Flächenanteil und ein geringerer Gewichtsanteil an Peptid können daher unterschiedliche Aspekte desselben Materials beschreiben.

Der vom NIST bereitgestellte technische Bericht der IUPAC zur Bestimmung der organischen Reinheit behandelt Massenbilanz- und quantitative Ansätze, einschließlich der Beiträge von Verunreinigungen und der Unsicherheit. Diese umfassendere Bestimmung stellt eine andere analytische Aufgabe dar als die Darstellung eines Peaks als Anteil eines Chromatogramms. NIST/IUPAC: Bestimmung des Wertes für die organische Reinheit.

Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn ein Forscher für ein quantitatives Experiment eine bestimmte Menge benötigt. Das Chromatogramm kann dabei helfen, die Verteilung der nachgewiesenen Substanzen zu charakterisieren, während eine kalibrierte Gehaltsbestimmung Aufschluss über die Menge des zu bestimmenden Analyten gibt.

Ein großer Gipfel braucht noch einen Namen

Die Größe eines Peaks und die Zuordnung eines Peaks sind zwei unterschiedliche Konzepte. Ein dominantes Signal könnte zum gesuchten Peptid, zu einer unerwarteten Verbindung oder zu nicht identifizierten Anteilen gehören. Die diesem Peak zugewiesene Bezeichnung muss durch analytische Belege gestützt werden.

Die Koelution ist hier ein besonders nützliches Konzept: Bestandteile, die durch das Verfahren nicht getrennt werden können, können innerhalb desselben Peaks auftreten. Eine übersichtliche Kurve lässt diese Frage nicht verschwinden. Entscheidend ist, ob die Methode die für die Analyse wichtigen Substanzen unterscheiden kann.

ICH Q2(R2) behandelt die Identitätsbestimmung, die Wirkstoffbestimmung und die Verunreinigungsmessung als eigenständige analytische Zwecke, wobei Validierungskennzahlen wie Selektivität, Genauigkeit und Präzision im Hinblick auf die jeweilige Aufgabe bewertet werden. Diese Leitlinie für pharmazeutische Methoden bietet einen nützlichen Rahmen für das Verständnis der Messleistung; sie weist einem Forschungsreagenz jedoch keinen pharmazeutischen Status zu. ICH Q2(R2): Validierung analytischer Verfahren.

Zwei Berichte können übereinstimmen, ohne dieselbe Frage zu beantworten

Betrachten wir zwei fiktive Berichte, die beide eine Reinheit von 99,1 % angeben. Bericht A enthält einen Hinweis auf Spurenstoffe und die verwendete Methode. Bericht B identifiziert zudem den Zielpeak, liefert separate Identitätsnachweise und gibt einen kalibrierten Gehaltswert an.

Für eine quantitative Kalibrierungsstudie liefert Bericht B Informationen, die in Bericht A fehlen. Das bedeutet jedoch nicht, dass sein Inhalt besser ist. Es bedeutet vielmehr, dass die Dokumentation mehr Fragen des Forschers beantwortet.

Wechseln wir nun das Thema. Der Forscher untersucht ein Verunreinigungsprofil vor und nach einem Belastungstest im Labor. Für den Vergleich sind vergleichbare Analyse- und Auswertungsbedingungen erforderlich. Ein Unterschied zwischen den Prozentwerten lässt sich nur schwer interpretieren, wenn bei einem Durchlauf eine kleine Schulter im Zielpeak mitberücksichtigt wird, während sie bei einem anderen Durchlauf separat integriert wird.

Lies den Wert ab, ohne ihn zu überlesen

Ein Ergebnis von 99,3 % ist numerisch größer als 99,0 %. Ob dieser Unterschied aussagekräftig ist, hängt vom Messkontext ab. Zusätzliche Dezimalstellen machen einen Bericht detaillierter; sie sind jedoch für sich genommen kein Hinweis auf eine höhere Genauigkeit oder ein besseres Material.

Ebenso kann ein gemeldeter Wert von 100 % bedeuten, dass keine der zusätzlich einbezogenen Peaks den Berichtsschwellenwert des Verfahrens überschritten hat. Es handelt sich weiterhin um eine durch die Methode begrenzte Beobachtung. Die aussagekräftigste Beschreibung orientiert sich eng an dieser Beobachtung: die Reinheit der HPLC-Flächen gemäß dem genannten Verfahren, wobei die ursprüngliche Kurve zur Interpretation zur Verfügung steht.

Anwendungsbereich im Labor: Dieser Artikel befasst sich mit der chromatographischen Auswertung zu Forschungszwecken. Ein Reinheitsgrad in Prozent sagt nichts über die Eignung für den menschlichen oder veterinärmedizinischen Gebrauch aus.