Un certificato riporta un picco alto e stretto e un risultato di purezza superiore al 99%. Sembra rassicurante. Per un ricercatore, però, la domanda interessante è: cosa ha misurato lo strumento per ottenere quella percentuale?

La risposta parte dal cromatogramma. Si tratta di una registrazione della risposta del rivelatore nel tempo, non di una fotografia di tutto ciò che si trova all’interno della fiala. Imparare a interpretare tale registrazione rende il dato relativo alla purezza più significativo e aiuta a spiegare perché debba essere considerato insieme ai risultati relativi all’identità e al contenuto.

Seguire il campione lungo la colonna

L'HPLC combina la separazione con la misurazione. I componenti attraversano una colonna, interagendo in modo diverso con la fase stazionaria e quella mobile. Quelli separati dal metodo raggiungono il rivelatore in momenti diversi.

Nella cromatografia peptidica in fase inversa, le condizioni della fase mobile, il gradiente e altre scelte metodologiche influenzano la ritenzione e la separazione. La descrizione metodologica di Mant e colleghi illustra queste relazioni e i diversi approcci cromatografici disponibili per i peptidi. Non esiste un unico insieme di condizioni HPLC che garantisca ogni risultato in termini di purezza. Mant et al.: Analisi e purificazione dei peptidi mediante HPLC.

Sulla traccia risultante, un picco è un periodo caratterizzato da una maggiore risposta del rivelatore. L'integrazione ne determina l'area applicando una linea di base e le regole di elaborazione del metodo. Il laboratorio procede quindi all'assegnazione dei picchi e decide quali aree includere nel calcolo riportato.

La percentuale è un calcolo in cui il denominatore è

In un risultato di normalizzazione dell'area, l'area target assegnata viene divisa per l'area totale inclusa e moltiplicata per 100. Il denominatore è importante quanto il picco target. Un segnale escluso, una soglia di integrazione o un contributo non risolto modificano il significato del calcolo.

Ciò che il rilevatore rileva non è tutto ciò che il materiale contiene

La composizione di un materiale peptidico può includere acqua, controioni e solventi residui. Questi componenti non sono necessariamente rappresentati in un calcolo di routine della purezza del peptide basato sull’area UV. Un’elevata percentuale in area e una frazione in peso del peptide inferiore possono quindi descrivere aspetti diversi dello stesso materiale.

Il rapporto tecnico dell’IUPAC, ospitato dal NIST, sulla determinazione della purezza delle sostanze organiche tratta il bilancio di massa e gli approcci quantitativi, compresi i contributi delle impurità e l’incertezza. Tale determinazione più ampia costituisce un’attività analitica diversa dall’esprimere un picco come proporzione di un cromatogramma. NIST/IUPAC: determinazione del valore di purezza delle sostanze organiche.

Ciò assume particolare rilevanza quando un ricercatore ha bisogno di una quantità definita per un esperimento quantitativo. Il cromatogramma può aiutare a caratterizzare la distribuzione delle specie rilevate, mentre una misurazione calibrata del contenuto fornisce la quantità dell’analita in questione.

Un grande picco ha ancora bisogno di un nome

La dimensione del picco e l’attribuzione del picco sono concetti distinti. Un segnale dominante potrebbe appartenere al peptide desiderato, a una specie inattesa o a contributi non identificati. L’etichetta assegnata a quel picco deve essere supportata da prove analitiche.

In questo contesto, il concetto di coeluzione risulta particolarmente utile: i componenti che la procedura non riesce a separare possono contribuire alla formazione dello stesso picco. Una traccia dall’aspetto ordinato non elimina questo problema. La questione rilevante è se il metodo sia in grado di distinguere le specie rilevanti ai fini dell’analisi.

La linea guida ICH Q2(R2) considera l’identificazione, la determinazione della concentrazione e la misurazione delle impurità come finalità analitiche distinte, per le quali vengono valutate caratteristiche di validazione quali selettività, accuratezza e precisione in relazione al compito previsto. Questa linea guida sui metodi farmaceutici fornisce un quadro di riferimento utile per comprendere le prestazioni di misurazione; essa non attribuisce lo status di prodotto farmaceutico a un reagente di ricerca. ICH Q2(R2): validazione delle procedure analitiche.

Due rapporti possono concordare senza rispondere alla stessa domanda

Si considerino due rapporti fittizi, entrambi indicanti una purezza in area del 99,1%. Il rapporto A include un riferimento alla traccia e al metodo. Il rapporto B identifica inoltre il picco di interesse, fornisce prove separate dell’identità e riporta un valore calibrato del contenuto.

Ai fini di uno studio di calibrazione quantitativa, il Rapporto B fornisce le informazioni che mancano nel Rapporto A. Ciò non significa che il suo contenuto sia superiore, ma dimostra che la documentazione risponde a un maggior numero di domande del ricercatore.

Ora cambiamo argomento. Il ricercatore sta esaminando il profilo delle impurità prima e dopo un esperimento di sollecitazione in laboratorio. Il confronto richiede condizioni analitiche e di elaborazione compatibili. È difficile interpretare una differenza tra le percentuali se in una serie di analisi è presente una piccola spalla nel picco di riferimento, mentre in un’altra questa viene integrata separatamente.

Leggi il valore con precisione, senza esagerare

Un risultato pari al 99,3% è numericamente superiore al 99,0%. Che tale differenza sia significativa dipende dal contesto di misurazione. L’aggiunta di ulteriori cifre decimali rende un rapporto più dettagliato; di per sé, tuttavia, non dimostra una maggiore precisione né la superiorità del materiale.

Allo stesso modo, un valore riportato pari al 100% può significare che nessun picco aggiuntivo incluso ha superato la soglia di segnalazione prevista dalla procedura. Si tratta comunque di un’osservazione limitata dal metodo stesso. La descrizione più utile rimane quella che si attiene a tale osservazione: la purezza dell’area HPLC secondo la procedura indicata, con la traccia originale disponibile per l’interpretazione.

Ambito di applicazione del laboratorio: il presente articolo riguarda l’interpretazione cromatografica a fini di ricerca. La percentuale di purezza non ne determina l’idoneità all’uso umano o veterinario.