“Nessuna crescita” è un risultato conciso, ma cosa si nasconde dietro? Il capitolo 71 dell’USP, relativo ai test di sterilità, prevede l’esame di campioni selezionati per individuare microrganismi recuperabili in condizioni di coltura. L’osservazione acquista significato solo se si considerano congiuntamente il lotto, il piano di campionamento e i controlli di recupero. Un risultato conforme fornisce una prova relativa all’esame stesso; non dimostra però che ogni singola unità del lotto sia sterile.

È più facile comprendere gli aspetti scientifici se si considera il rapporto come il risultato finale di una serie di decisioni: quali unità esaminare, come isolare i microrganismi, come controllare il test e come interpretare i risultati ottenuti.

Dare ai microrganismi la possibilità di essere individuati

La Farmacopea degli Stati Uniti pubblica il Capitolo Generale 71, “Prove di sterilità”. Esso definisce un esame previsto dalla farmacopea, con il capitolo attualmente in vigore e la procedura di laboratorio applicabili che regolano l’attività effettiva. Un riferimento al metodo non costituisce un’approvazione concessa a un fornitore.

I test di coltura convenzionali consentono ai microrganismi vitali di proliferare in terreni di coltura specifici. Esistono due approcci principali per introdurre il campione in tale esame. Nella filtrazione su membrana, i potenziali microrganismi vengono trattenuti su una membrana e analizzati tramite coltura. Nell’inoculazione diretta, il materiale viene introdotto direttamente nei terreni di coltura. La scelta dell’approccio appropriato dipende dal materiale e dalla procedura convalidata.

Bugno e colleghi hanno utilizzato il test convenzionale di filtrazione su membrana come termine di paragone in uno studio su un sistema di rilevamento automatizzato. Il loro metodo convenzionale prevedeva l’uso di due terreni di coltura e un periodo di osservazione di 14 giorni. Quanto sopra descrive l’esame valutato, piuttosto che fornire una procedura da seguire tratta da un articolo pubblicato sul web. Confronto delle prestazioni dei test di sterilità.

Perché il materiale può influire negativamente sul risultato

Anche una procedura consolidata deve comunque essere applicata al campione effettivo. Se una formulazione inibisce la crescita microbica, un risultato negativo potrebbe riflettere tale inibizione anziché l’assenza di contaminazione. Il capitolo 1227 dell’USP spiega perché i metodi farmacopeici richiedono la prova del recupero dell’organismo di prova in presenza del prodotto. USP sulla convalida del recupero microbico.

Si tratta dell’idoneità del metodo: il nesso tra un test e il materiale che esso analizza. Un risultato positivo ottenuto con una formulazione diversa non stabilisce tale nesso per questo campione. La composizione, i conservanti e la concentrazione devono essere presi in considerazione nella discussione perché contribuiscono a definire ciò che il metodo va ad analizzare.

L’ambiente di analisi è importante anche dal punto di vista opposto. La contaminazione introdotta durante l’esame può determinare una proliferazione batterica che non ha origine nel campione inviato. Le linee guida della FDA trattano le prestazioni dei terreni di coltura e i controlli di laboratorio necessari a garantire un’interpretazione affidabile. I controlli di recupero, i terreni di coltura che favoriscono la proliferazione batterica e un ambiente controllato affrontano ciascuno un diverso tipo di errore potenziale. La FDA sui controlli di laboratorio.

Il campione non può rappresentare ogni singola unità

Un test su lotto prevede normalmente l’esame di una selezione di unità. Tale selezione deve rispecchiare il processo e i relativi rischi. L’Allegato 1 della Commissione europea considera il test di sterilità del prodotto finito come parte integrante di un sistema di controllo più ampio, con campioni rappresentativi che includono le parti del lotto a maggior rischio. Allegato 1, sezioni 10.5–10.6.

Il motivo è sia statistico che microbiologico. Un campione di piccole dimensioni può non rilevare la contaminazione anche se il metodo utilizzato individua tutte le unità contaminate che incontra. Il calcolo che segue mette in evidenza tale limite senza prescrivere un piano di campionamento.

Interpretare il “no alla crescita” come risultato analitico

Il risultato indica che non è stata rilevata alcuna crescita nei campioni esaminati nelle condizioni riportate, con campionamenti e controlli validi a sostegno di tale interpretazione. Le linee guida della FDA relative ai contenitori e alle chiusure sottolineano che i test colturali rilevano solo i microrganismi in grado di crescere nelle condizioni di prova. Poiché i test sono distruttivi, la stessa unità esaminata non può essere sottoposta a un nuovo test nel suo stato originale. La FDA sui limiti dei test di sterilità.

Tale risultato riguarda i microrganismi recuperabili. Lascia invece ad altri metodi l’analisi di altri aspetti: l’attività endotossinica, le impurità chimiche e l’integrità della confezione nel tempo. La lettura congiunta dei risultati complementari fornisce un quadro più completo, senza trasformare un singolo test in una garanzia generale di qualità.

Cosa succede quando si osserva una crescita?

Un risultato positivo alla coltura richiede un’indagine. La FDA mette in guardia dal liquidarlo come contaminazione di laboratorio in assenza di prove conclusive e documentate. Ripetere l’esame fino a ottenere un risultato soddisfacente non spiega l’osservazione iniziale. Il risultato, eventuali scostamenti e l’indagine devono essere riportati nella documentazione. La FDA sull’indagine relativa ai risultati positivi alla sterilità.

I metodi rapidi sollevano una questione correlata relativa all'interpretazione dei risultati. Nello studio di Bugno, il sistema automatizzato ha rilevato gli organismi sottoposti a test in tempi più rapidi. Tale confronto conferma le condizioni oggetto dello studio; un rapporto che utilizzi un altro metodo deve presentare una procedura specificata e prove pertinenti della sua idoneità.

I dettagli che rendono un rapporto di facile lettura

La riga dei risultati risulta più comprensibile quando il record che la circonda riporta il nome del lotto sottoposto a analisi, la descrizione del campione, il numero di unità esaminate, il metodo utilizzato e le date delle analisi. I controlli e le deviazioni chiariscono se l’osservazione conferma la conclusione indicata. Tali dettagli consentono al lettore di seguire il percorso delle prove anziché limitarsi ad accettare una semplice affermazione.

Il Capitolo 71 dell’USP risulta quindi particolarmente utile nell’ambito di una relazione analitica documentata. Il test fornisce una risposta a una specifica questione microbiologica, mentre il contesto relativo al campionamento e al recupero spiega la validità e i limiti di tale risposta.