Op een certificaat is één hoge, smalle piek te zien en een zuiverheidsresultaat van meer dan 99%. Dat ziet er geruststellend uit. Voor een onderzoeker is de interessante vraag echter wat het instrument precies heeft gemeten om tot dat percentage te komen.

Het antwoord begint bij het chromatogram. Het is een registratie van de reactie van de detector in de loop van de tijd, geen foto van alles wat zich in het flesje bevindt. Als je leert hoe je die registratie moet interpreteren, wordt het zuiverheidscijfer veelzeggender en wordt duidelijker waarom het naast de resultaten voor identiteit en samenstelling hoort te staan.

Volg de monsterstroom door de kolom

Bij HPLC worden scheiding en meting gecombineerd. De bestanddelen stromen door een kolom, waarbij ze op verschillende manieren in wisselwerking staan met de stationaire en mobiele fase. De bestanddelen die door deze methode worden gescheiden, bereiken de detector op verschillende tijdstippen.

Bij peptidechromatografie met omgekeerde fase beïnvloeden de omstandigheden van de mobiele fase, de gradiënt en andere methodologische keuzes de retentie en de scheiding. In het methodologische overzicht van Mant en collega’s worden deze verbanden en de verschillende chromatografische benaderingen die voor peptiden beschikbaar zijn, toegelicht. Er bestaat geen enkele vaste set HPLC-omstandigheden die elk zuiverheidsresultaat bepaalt. Mant et al.: HPLC-analyse en zuivering van peptiden.

Op de resulterende curve is een piek een periode waarin de detector een verhoogde respons vertoont. Door integratie wordt de oppervlakte van de piek bepaald, waarbij een basislijn wordt toegepast en de verwerkingsregels van de methode worden gevolgd. Het laboratorium wijst vervolgens de pieken toe en bepaalt welke oppervlakten in de gerapporteerde berekening worden meegenomen.

Het percentage is een berekening met een noemer

Bij een resultaat op basis van oppervlaktenormalisatie wordt de toegewezen doeloppervlakte gedeeld door de totale meegenomen oppervlakte en vermenigvuldigd met 100. De noemer is net zo belangrijk als de doelpiek. Een uitgesloten signaal, een integratiedrempel of een niet-opgeloste bijdrage verandert wat de berekening weergeeft.

Wat de detector waarneemt, is niet alles wat het materiaal bevat

De samenstelling van een peptidemateriaal kan bestaan uit water, tegenionen en restoplosmiddelen. Deze componenten worden niet noodzakelijkerwijs meegenomen in een standaardberekening van de zuiverheid van een peptide op basis van het UV-oppervlak. Een hoog oppervlaktepercentage en een lager gewichtspercentage aan peptide kunnen daarom verschillende aspecten van hetzelfde materiaal beschrijven.

Het door het NIST gepubliceerde technische rapport van de IUPAC over de vaststelling van de zuiverheid van organische stoffen gaat in op massabalans en kwantitatieve benaderingen, met inbegrip van de bijdragen van onzuiverheden en onzekerheid. Die bredere vaststelling is een andere analytische taak dan het uitdrukken van één piek als een percentage van een chromatogram. NIST/IUPAC: vaststelling van de zuiverheidswaarde van organische stoffen.

Dit is met name van belang wanneer een onderzoeker een bepaalde hoeveelheid nodig heeft voor een kwantitatief experiment. Het chromatogram kan helpen bij het in kaart brengen van de verdeling van de gedetecteerde stoffen, terwijl een gekalibreerde gehaltemeting de hoeveelheid van de beoogde analyt vaststelt.

Een grote piek moet nog een naam krijgen

De grootte van een piek en de toewijzing van een piek zijn twee verschillende zaken. Een dominant signaal kan afkomstig zijn van het beoogde peptide, van een onverwachte verbinding of van niet-geïdentificeerde bijdragen. De aanduiding die aan die piek wordt toegekend, moet worden onderbouwd met analytisch bewijs.

Coëlutie is hier een bijzonder nuttig begrip: bestanddelen die door de procedure niet van elkaar kunnen worden gescheiden, kunnen binnen dezelfde piek voorkomen. Een overzichtelijk ogende chromatogram maakt deze vraag niet ongedaan. Het gaat erom of de methode de voor de analyse relevante stoffen van elkaar kan onderscheiden.

In ICH Q2(R2) worden identiteitsbepaling, gehaltemeting en het meten van onzuiverheden beschouwd als afzonderlijke analytische doeleinden, waarbij validatiekenmerken zoals selectiviteit, nauwkeurigheid en precisie worden beoordeeld in het licht van de beoogde taak. Deze richtlijn voor farmaceutische methoden biedt een nuttig kader voor het begrijpen van de meetprestaties; zij kent geen farmaceutische status toe aan een onderzoeksreagens. ICH Q2(R2): validatie van analytische procedures.

Twee rapporten kunnen met elkaar overeenkomen zonder dat ze dezelfde vraag beantwoorden

Laten we eens kijken naar twee fictieve rapporten, die beide een zuiverheid van 99,1% aangeven. Rapport A bevat een verwijzing naar het spoor en de methode. Rapport B identificeert ook de doelpiek, levert afzonderlijk bewijs voor de identiteit en vermeldt een gekalibreerde gehaltewaarde.

Voor een kwantitatief kalibratieonderzoek vult Rapport B de informatie aan die in Rapport A ontbreekt. Dat betekent niet dat de inhoud ervan superieur is. Het betekent wel dat de documentatie meer vragen van de onderzoeker beantwoordt.

Laten we nu eens van taak veranderen. De onderzoeker bestudeert een onzuiverheidsprofiel voor en na een laboratoriumtest onder belasting. Voor de vergelijking zijn vergelijkbare analyse- en verwerkingsomstandigheden nodig. Een verschil in de percentages is moeilijk te interpreteren als bij de ene meting een kleine schouder in de doelpiek wordt meegenomen en bij de andere deze apart wordt geïntegreerd.

Lees de waarde nauwkeurig af, zonder te ver te kijken

Een resultaat van 99,3% is numeriek gezien groter dan 99,0%. Of dat verschil betekenisvol is, hangt af van de meetcontext. Extra decimalen maken een rapport gedetailleerder; ze duiden op zichzelf niet op een grotere nauwkeurigheid of een beter materiaal.

Evenzo kan een gerapporteerde waarde van 100% betekenen dat geen van de meegenomen pieken de rapportagedrempel van de procedure heeft overschreden. Het blijft een waarneming die beperkt is tot de methode. De meest bruikbare beschrijving sluit nauw aan bij die waarneming: de zuiverheid van het HPLC-oppervlak volgens de genoemde procedure, waarbij de oorspronkelijke curve beschikbaar is voor interpretatie.

Toepassingsgebied van het laboratorium: Dit artikel heeft betrekking op de interpretatie van chromatografische resultaten voor onderzoeksdoeleinden. Een zuiverheidspercentage zegt niets over de geschiktheid voor gebruik bij mensen of dieren.